Evaluación del efecto de la carga enzimática, sobre la capacidad de reactivación de catalizadores de PGA parcialmente inactivados

Erick Araya Garmendia 

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La biocatálisis enzimática en los últimos años, ha sido una herramienta muy útil en la búsqueda y obtención de productos con mayor valor agregado en diferentes industrias, destacando la alimentaria y la farmacéutica. Sin embargo las enzimas, provienen de sistemas vivos, donde las condiciones ambientales en que se encuentran, por lo general, no son las mismas que en una condición de proceso. Su naturaleza proteica las hace lábiles al momento de someterlas a elevadas temperaturas o medios de reacción no acuosos, entre otras condiciones de proceso, llevándolas a que sufran cambios conformacionales lo que implica una pérdida parcial o total de su actividad catalítica. La inmovilización enzimática ha permitido aumentar la vida útil del catalizador, dado a que permite la recuperación, reutilización y además, el mejoramiento de la estabilidad de estos en condiciones no convencionales, pero pese el aporte de la inmovilización, de todas formas las enzimas gradualmente se van inactivando.

Las técnicas de reactivación enzimáticas (incubación en medio acuoso y de desplegamiento- replegamiento), han logrado revertir algunos cambios conformacionales que se producen por agentes denaturantes, pero cuando no se ha logrado reactivar totalmente la enzima, una teoría ha sido propuesta, en donde la carga del biocatalizador podría tener un efecto importante. En un biocatalizador de alta carga enzimática, a medida que se inactiva se pueden producir las interacciones entre proteínas vecinas que pueden llevar a la formación de nuevos enlaces entre ellas afectando el proceso de reactivación enzimática. Por el contrario, cuando se posee un catalizador de baja carga, se podrían evitar estas interacciones, debido al mayor distanciamiento entre una enzima y otra, no obstante, hay un costo de oportunidad alto, dado a que su baja capacidad catalítica lo puede hacer incompatible para una condición de proceso.

El objetivo de esta memoria es: "Evaluar el efecto de la carga enzimática en biocatalizadores de penicilina G acilasa (PGA) parcialmente inactivados, térmicamente y por solvente orgánico, sobre la capacidad de reactivación".

Alumno: Erick Araya G. Memorista Ing. Civil Bioquímica.

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Profesor(es) guía: Lorena Wilson, Zaida Cabrera.

email: lwilson@ucv.cl

Evaluación del potencial de la lipasa de Geobacillus thermocatenulatus para catalizar la síntesis asimétrica del R-monobenzoil glicerol

Nadia Guajardo R.

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El objetivo general de este proyecto consiste en evaluar el potencial de la lipasa no comercial de Geobacillus thermocatenulatus (BTL2) clonada, expresada en E. coli. e inmovilizada, en la esterificación asimétrica del glicerol (nucleófilo) con anhídrido benzoíco (donador de acilo) para la obtención del R-MBG, compuesto ópticamente activo que sirve como precursor para la elaboración de fármacos quirales como los β- bloqueantes, usados para tratar arritmias cardiacas, infarto al miocardio e hipertensión. Para cumplir con este objetivo, se estudiará el efecto de la ingeniería de la reacción (ingeniería del biocatalizador y del medio de reacción) sobre la enantioselectidad de la enzima. Con el propósito de modular las propiedades catalíticas de la lipasa BTL2, debido a su complejo mecanismo catalítico al poseer dos lid cubriendo su sitio activo, se estudiará su inmovilización sobre soportes monofuncionales y heterofuncionales.

Alumno: Nadia Guajardo. Tesista de Doctorado.

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Profesor(es) guía: Lorena Wilson S.

email: lwilson@ucv.cl.

Síntesis enzimática de lactulosa y evaluación de su capacidad prebiótica

Cecilia Guerrero

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Lactulosa, es un oligosacárido no digerible (NDOs) con reconocida capacidad prebiótica. Lactulosa fue el primer derivado de lactosa bioactivo que se comercializó y es principalmente producida por síntesis química mediante isomerización alcalina de la lactosa. Sin embargo, esta síntesis posee una serie de problemas asociados como por ejemplo: ser poco específica y la reactividad de los catalizadores químicos utilizados, que provocan la formación de productos secundarios indeseables, como ácidos isosacáridos y compuestos coloreados, los cuales para eliminarse requieren de varias etapas de purificación. Es por este motivo que, la síntesis enzimática surge como una alternativa atractiva para la producción de lactulosa, ya que en principio, puede resolver la poca especificidad y las reacciones indeseables antes mencionadas siendo posible además, producir simultáneamente otros compuestos prebióticos (galacto-oligosacáridos, GOS) como productos de la reacción.
La síntesis enzimática de lactulosa con β-galactosidasas, se lleva a cabo utilizando lactosa y fructosa como sustratos de la reacción. Dentro de las β-galactosidasas utilizadas comúnmente para la síntesis de oligosacáridos transgalactosilados, la de Aspergillus oryzae es utilizada ampliamente, ya que es de bajo costo y está disponible para su uso industrial, posee el sello GRAS y posee alta actividad de transgalactosilación. Las β-galactosidasas son utilizadas principalmente en procesos de hidrólisis de lactosa, no obstante esta enzima tiene la capacidad de transferir la galactosa de un β-galactósido a un aceptor que posea un grupo hidroxilo, en el caso de las reacciones hidroliticas el agua actúa como aceptor de la galactosa, sin embargo, otras azúcares presentes en la solución pueden actuar como este aceptor, por ejemplo: lactosa, fructosa. Es por esto, que es posible la síntesis de otros compuestos transgalactosilados, obteniendo mezcla de oligosacáridos en el medio de reacción. Dado que, en el medio de la síntesis de lactulosa están presentes tanto lactosa como fructosa, ambos azúcares pueden convertirse en aceptor, dando origen a la síntesis de lactulosa y galacto-oligosacáridos. Esto es una desventaja desde el punto de vista de la purificación de la lactulosa, debido a que la separación de dos azúcares es costosa. Sin embargo, los GOS pueden ser considerados un subproducto de alto valor agregado, ya que son azúcares con alta capacidad prebiótica.
El objetivo de esta investigación es "Determinar las condiciones de la reacción de síntesis enzimática de lactulosa con β-galactosidasa de Aspergillus oryzae, que permitan maximizar la capacidad prebiótica de los productos de la reacción".

Alumno: Cecilia Guerrero S. Tesista  de Doctorado.

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Profesor(es) guía: Andrés Illanes F.

email: aillanes@ucv.cl

Evaluación de restricciones difusionales de catalizadores de penicilina G acilasa inmovilizada en glioxil agarosa parcialmente inactivados

Jessica Holtheuer.

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En las últimas décadas, el uso de enzimas, ha adquirido gran importancia, en investigación y desarrollo tecnológico. A nivel industrial, éstas habitualmente necesitan ser inmovilizadas para lograr una mejor estabilidad, recuperación y reutilización. Un ejemplo de esto es la producción industrial de ácido 6-aminopenicilánico por hidrólisis de penicilina mediante la penicilina G y penicilina V acilasas que se ha realizado por más de dos décadas, siendo esta la molécula base en la síntesis de antibióticos derivados de la penicilina.

A pesar de los beneficios de usar enzimas inmovilizadas, la inmovilización genera pérdidas parciales de actividad debido a cambios conformacionales o a raíz de inactivación junto con la aparición de restricciones difusionales determinadas por la velocidad con que sustratos y productos difunden hacia y desde el catalizador.

La pérdida parcial de actividad se debe a que una de las características de los catalizadores enzimáticos es la facilidad con que se desnaturalizan térmicamente dentro de un rango relativamente estrecho de temperatura en comparación con la mayoría de los catalizadores inorgánicos. Ésta, dependiendo de la temperatura a la cual se exponga puede ser reversible o irreversible. En el caso de utilización de enzimas inmovilizadas en partículas porosas el efecto de difusión intra e inter partículas adquiere importancia.

Se estudia la enzima penicilina acilasa inmovilizada mediante unión covalente a un soporte sólido parcialmente inactivada. La reacción de hidrólisis de penicilina G catalizada por esta enzima considera doble inhibición por parte de los productos ácido fenilacético (AFA) y ácidos 6-aminopenicilánico (6-APA).

Esta investigación propone estudiar el efecto de la inactivación sobre las propiedades del sistema. Esto implica la determinación de los perfiles de reacción utilizando la enzima inmovilizada, mediante el método de las velocidades iniciales y la determinación de los parámetros difusionales, mediante medición de la velocidad de difusión, cuantificando parámetros tales como el módulo de Thiele y su respectivo factor de efectividad. El catalizador será inactivado térmicamente, hasta un cierto nivel de actividad residual y se le medirán sus parámetros cinéticos junto con la medición de los efectos de las restricciones difusionales internas.

El objetivo general de este trabajo es estudiar el efecto de la inactivación del biocatalizador sobre el impacto de las restricciones difusionales internas en la reacción de hidrólisis de penicilina G con penicilina G acilasa inmovilizada inicialmente a una tamaño de partícula sobre los 200 µm de diámetro a una elevada carga enzimática.

Alumno: Jessica Holtheuer. Tesista de Magister

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Profesor(es): Andrés Illanes y Lorena Wilson

email: aillanes@ucv.cl, lwilson@ucv.cl

Evaluación de estrategias de recuperación y reciclaje de celulasas en la operación de hidrólisis de lignocelulosa para la producción de etanol

Lorena Soler H.

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El creciente interés en el desarrollo de fuentes energéticas renovables, que puedan competir y, en el futuro, reemplazar a los combustibles fósiles tradicionales, se ve reflejado en la gran cantidad de trabajos de investigación en esta área.

En este contexto, la ingeniería de enzimas y la biocatálisis enzimática son áreas importantes de investigación para el desarrollo y obtención de biocatalizadores que puedan ser utilizados industrialmente para la producción de fuentes energéticas. En general, los procesos enzimáticos tienen la ventaja de ser “ambientalmente favorables”, esto al compararlos con los procesos químicos tradicionales que requieren de condiciones extremas de pH y temperatura, los productos son difíciles de purificar y utilizan compuestos que muchas veces son tóxicos o altamente contaminantes. Además, los catalizadores enzimáticos son altamente específicos, por lo que se evita la síntesis de subproductos indeseados y los productos de la reacción son, en general, puros y fácilmente recuperables.

Por otro lado, y ante el rápido avance de las investigaciones en el área de los biocombustibles y su posterior fabricación a nivel industrial en distintas partes del mundo, surge la preocupación acerca de la utilización de recursos que tradicionalmente habían estado destinados a la alimentación humana o animal, para fines energéticos. Ante esto, aparece la necesidad de utilizar materias primas cuya producción no compita con la de alimentos o que provengan de los desechos de otras actividades productivas. Es así, como nace una segunda generación de biocombustibles, dentro de los cuales está el etanol lignocelulósico.

En el proceso productivo del etanol a partir de lignocelulosa, el paso limitante es justamente la hidrólisis de la celulosa para la obtención de azúcares fermentables. Muchas investigaciones se han enfocado en la obtención de preparados enzimáticos capaces de hidrolizar eficientemente la estructura cristalina de la celulosa, y en la actualidad existen preparados comerciales de celulasas y otras enzimas auxiliares fabricadas específicamente para este proceso que, hasta ahora, se utilizan a nivel de laboratorio para investigaciones que buscan encontrar condiciones óptimas para la hidrólisis de la celulosa proveniente de distintas fuentes.

Entonces, disponiendo de preparados enzimáticos comerciales, lo que se hace necesario es contar con metodologías y condiciones que optimicen el uso tanto de los biocatalizadores como de las materias primas, considerando su posible escalamiento a nivel industrial, con lo que se hace interesante la posibilidad de reutilizar los catalizadores, considerando además que los costos de estas enzimas aún siguen siendo elevados.

Este trabajo está orientado a la aplicación de preparados enzimáticos comerciales para la hidrólisis de madera de eucaliptus y pino, para obtener azúcares fermentables que puedan ser utilizados para la producción de etanol, estudiando el comportamiento de las enzimas en cuanto a su adsorción a los sustratos pensando en su posible recuperación y diseño de una modalidad de operación que permita la recuperación y reutilización de los catalizadores.

El objetivo general de esta tesis es desarrollar una modalidad de operación que permita llevar a cabo la hidrólisis de material lignocelulósico (madera pretratada) a altas concentraciones de sustrato con recuperación y reciclaje de los catalizadores, basándose en el comportamiento de adsorción de las distintas enzimas que actúan en la reacción de hidrólisis sobre los sustratos.

Alumno: Lorena Soler Hyde. Tesista de Doctorado.

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Profesor(es): Andrés Illanes y Germán Aroca.

email: aillanes@ucv.cl, garoca@ucv.cl

Optimización de la síntesis de galacto-oligosacáridos en modalidad de lote alimentado

Carlos Vera V

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Los galacto-oligosacáridos (GOS) son carbohidratos no digeribles de con reconocida capacidad prebiótica. Los GOS son sintetizados a partir de lactosa usando β-galactosidasas, por lo que representan una alternativa de revalorización de la lactosa, la cual es responsable de gran parte de la demanda bioquímica de oxígeno (DBO) a remover cuando el permeado de suero o el suero de quesearía es tratado como un desecho. Si bien, la lactosa puede ser removida del suero de quesería, su uso en la industria es reducido. La intolerancia a la lactosa sufrida por gran parte de la población, su baja solubilidad y su tendencia a cristalizar a bajas temperaturas ha limitado su aplicación industrial. Por lo tanto, su conversión en un ingrediente prebiótico, libre de los problemas asociados a la lactosa, es beneficiosa y muy atractiva para la industria de alimentos. Además, las síntesis de GOS tiene la ventaja ser una reacción catalizada por β-galactosidasas, siendo estas enzimas ampliamente estudias y empleadas en la industria lo que asegura su robustez, disponibilidad y bajo costo.

La síntesis de galacto-oligosacáridos con β-galactosidasas es cinéticamente controlada, lo cual tiene por consecuencia que la reacción de síntesis de oligosacáridos resulta de un balance entre la actividad enzimática de síntesis e hidrólisis de oligosacáridos. Dado que, la síntesis esta cinéticamente controlada es que las características del producto (grado de polimerización alcanzado y distribución del grado de polimerización), rendimiento, conversión y velocidad de reacción dependen fuertemente de la fuente enzimática utilizada. En la literatura, han sido reportados rendimientos sobre el 64%. Sin embargo, las enzimas usadas para estos estudios no resultan ser apropiadas para su uso en alimentos y son onerosas. Además, muchas de ellas provienen de fuentes comercialmente no disponibles o no disponibles en cantidad suficiente para su uso industrial. Cuando se utilizan β-galactosidasas de uso industrial como la de Kluyveromyces lactis, Aspergillus oryzae, Bacillus circulans, Bacillus sp. el porcentaje máximo de GOS se encuentran entre 15 y 40% de los azúcares totales.

El uso de la β-galactosidasa de Aspergillus oryzae como catalizador en la síntesis de galacto-oligosacáridos (GOS) presenta como ventaja, que esta enzima está ampliamente disponible y a bajo costo para su uso en la industria de alimentos, posee una alta productividad específica, no requiere de cofactores metálicos, es estable térmicamente a temperaturas entre 40-55°C y produce principalmente trisacáridos y azúcares de mayor grado de polimerización. Sin embargo, tiene como desventaja un menor porcentaje de GOS totales en el producto de reacción respecto del obtenido con lactasas bacterianas y de levaduras, siendo este último aspecto, un problema tecnológico en el cual esta investigación pretende ser un aporte para su solución.

El objetvo de esta investigación es: “Determinar las condiciones operacionales que maximizan el beneficio económico obtenido en la síntesis por lote alimentado de GOS”.

Alumno: Carlos Vera V.

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Proferor(es) guía: Andrés Illanes y Raúl Conejeros.

email: aillanes@ucv.cl , rconej@ucv.cl